Мухоловки-пеструшки встречаются во всех типах лесных биотопов, в парках и садах. Для устройства гнезда этим птицам необходимы дупла, поэтому в городе пеструшки многочисленны только на пролете, а в период гнездования остаются лишь там, где есть старые дуплистые деревья или развешены искусственные гнездовья — дуплянки. Развеской синичников можно значительно повысить плотность населения этого вида. В лесах мухоловок-пеструшек обеспечивают дуплами дятлы и некоторые виды синиц.
Самец, прилетающий раньше, выбирает гнездовой участок с дуплом и поет, привлекая самку. После появления самки начинается строительство гнезда, которое строит только самка. В качестве строительного материала используются прошлогодние листья, тонкие чешуйки березовой и сосновой коры, травинки, корешки. Постройка получается довольно рыхлой. Внутреннюю поверхность гнезда — лоток, самка выстилает шерстью животных. Откладка яиц начинается во второй половине мая. Количество яиц в полной кладке от 5 до 7, они голубого цвета. Насиживает самка, самец в это время подкармливает ее. Через 11−13 дней появляются птенцы. Родители прилетают с кормом очень часто, до 20 — 40 раз в час. Птенцы пеструшек покидают гнездо позже чем дети открытогнездящихся видов птиц, в возрасте 15 — 16 дней. К этому времени они уже в состоянии перепархивать с ветки на ветку. Взрослые продолжают их кормить еще около двух недель после вылета.
Отлет на зимовку начинается в конце июля и продолжается до середины сентября и позднее, хотя отдельные особи могут встречаться и позднее, до октября. Мухоловки-пеструшки проводят зиму в экваториальной части Африки.